Détermination de novo des structures moustiquecides Cry11Aa et Cry11Ba à partir de sources naturelles

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 4376 (2022) Citer cet article

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Cry11Aa et Cry11Ba sont les deux toxines les plus puissantes produites par Bacillus thuringiensis subsp. israelensis et jegathesan, respectivement. Les toxines se cristallisent naturellement dans l'hôte ; cependant, les cristaux sont trop petits pour la détermination de la structure aux sources synchrotron. Par conséquent, nous avons appliqué une cristallographie femtoseconde en série avec des lasers à électrons libres à rayons X à des nanocristaux cultivés in vivo de ces toxines. La structure de Cry11Aa a été déterminée de novo à l’aide de la méthode de dispersion anormale à longueur d’onde unique, qui à son tour a permis la détermination de la structure de Cry11Ba par remplacement moléculaire. Les deux structures révèlent un nouveau modèle de cristallisation in vivo des toxines Cry, dans lequel chacun de leurs trois domaines est doté d'un domaine symétriquement identique et un motif d'emballage cristallin clivable est situé dans la protoxine plutôt qu'aux extrémités. La diversité des modèles de cristallisation in vivo suggère des explications pour leurs différents niveaux de toxicité et des approches rationnelles pour améliorer ces toxines pour lutter contre les moustiques.

Les insecticides biologiques les plus couramment utilisés pour lutter contre les populations de moustiques et de mouches noires sont produits par la bactérie Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti), découvert en Israël en 19761. Ces produits ciblent le stade larvaire d'une grande variété de vecteurs et, en raison de leur grande efficacité et de leur sécurité environnementale, ont remplacé les insecticides chimiques de synthèse à large spectre dans de nombreux programmes de lutte antivectorielle. Il s'agit notamment d'Anopheles gambiae et d'espèces apparentées qui transmettent le paludisme, ainsi que de nombreuses espèces de Culex et d'Aedes qui propagent des virus tels que ceux qui provoquent l'encéphalite du Nil occidental et la fièvre jaune. Les produits Bti sont également utilisés en Afrique pour réglementer les espèces de mouches noires responsables du vecteur des vers filaires responsables de la cécité des rivières. Outre les populations de vecteurs, ils sont utilisés pour lutter contre les moustiques nuisibles dans la vallée du Rhin en Allemagne, en Camargue dans le sud de la France et partout aux États-Unis, en Asie et en Amérique latine et du Sud, avec des milliers de tonnes appliquées au cours des 30 dernières années.

L'activité moustiquecide très puissante du Bti est due à trois formes nanocristallines de quatre protoxines, à savoir. Cyt1Aa, Cry11Aa et Cry4Aa et Cry4Ba co-cristallisés. Ceux-ci sont produits pendant la sporulation et sont remarquablement stables dans diverses conditions, mais se dissolvent après ingestion sous les niveaux de pH alcalins élevés caractéristiques de l’intestin moyen des larves de moustiques2. Les protoxines solubilisées sont activées par les protéases intestinales des insectes, permettant ainsi la liaison aux membranes des cellules intestinales, une oligomérisation ultérieure et, finalement, une lyse des cellules intestinales conduisant à la mort des larves2. Les toxines Bti sont sans danger pour l’environnement car elles sont beaucoup plus spécifiques aux moustiques cibles que les larvicides chimiques à large spectre.

La plus puissante des quatre toxines Bti est Cry11Aa, mais son activation et son mécanisme de toxicité sont mal compris, en grande partie parce que contrairement à Cry4Aa, Cry4Ba et Cyt1Aa, sa structure est inconnue. Une toxine apparentée produite par Bt subsp. le jegathesan (Btj) est Cry11Ba, qui est sept à trente-sept fois plus toxique que Cry11Aa contre les principales espèces de moustiques vecteurs appartenant aux genres Aedes, Anopheles et Culex3, et chez certains hôtes bactériens, il semble former des cristaux légèrement plus gros. La structure de Cry11Ba est également inconnue, bien qu'elle ait été utilisée en remplacement de Cry11Aa dans des souches recombinantes de Bti pour améliorer de manière significative l'activité moustiquecide3,4. Ainsi, notre objectif était de déterminer les structures des protoxines Cry11Aa et Cry11Ba pour aider à comprendre comment elles parviennent à la formation de cristaux robustes et labiles uniquement à un pH alcalin, et d'obtenir des informations structurelles pour augmenter l'efficacité de ces protéines dans la lutte contre les moustiques.

La détermination de la structure des protoxines Cry11Aa et Cry11Ba à partir de nanocristaux naturels nécessite une technologie de pointe. La cristallographie conventionnelle est limitée aux projets dans lesquels les cristaux sont suffisamment grands pour monter et osciller individuellement dans un faisceau de rayons X synchrotron. Dans le passé, les cristaux de Cry4Aa5, Cry4Ba6 et Cyt1Aa7 activés atteignaient une taille suffisante en les cultivant in vitro à partir de toxines dissoutes à partir de nanocristaux naturels et en activant les toxines par voie enzymatique. Cependant, Cry11Aa et Cry11Ba ne recristallisent pas in vitro à partir de nanocristaux dissous8. De plus, l’activation enzymatique n’est pas souhaitée puisque notre objectif est de comprendre le mécanisme de dissolution des cristaux naturels, contrôlé par le pH. Pour observer l'état de la protoxine dans les nanocristaux naturels produits dans les cellules bactériennes, nous avons appliqué la cristallographie femtoseconde en série (SFX) sur des lasers à électrons libres à rayons X (XFEL)9,10,11. Dans l'expérience SFX, des impulsions de faisceau XFEL à haute brillance, chacune d'une durée d'environ 10 à 50 fs, interceptent une série de nanocristaux, une impulsion par cristal, provoquant le signal de diffraction le plus puissant possible de chaque petit cristal avant qu'il ne se vaporise et produisant un série d’instantanés de diffraction, ensuite assemblés en un ensemble de données complet. La faisabilité de cette stratégie a été démontrée par la récente élucidation de la cascade complète de bioactivation de Cyt1Aa12.

3 residues) between α3 and α4 (−5 and −8 residues with respect to Btk Cry2Aa and Btt Cry3Aa), and β20 and β21 (−10 and −9 residues with respect to Btk Cry2Aa and Btt Cry3Aa). Altogether, these changes render Cry11 toxins uniquely large from the structural standpoint, with predicted radii of gyration of 27.5 and 26.7 Å for Cry11Aa and Cry11Ba, compared to 25.0 and 25.6 Å for Btk Cry2Aa and Btt Cry3Aa, respectively./p>370,000 patterns (native and three derivatives) collected on crystals with ~100,000 unit cell28. Our success in phasing the Cry11Aa structure likely stemmed from a combination of the use of a dramatically powerful phasing agent16,17 and advances in SFX data processing tools over the last five years, including the Xgandalf56 indexing algorithm and improvements in data handling and integration in CrystFEL57. It should offer hope to investigators seeking to determine the structure of proteins of which no known structural homologue exists and that have to resort to SFX due to smallness of their crystals. It is foreseeable, however, that de novo structure determination will be helped by recent advances in comparative and ab initio modelling and the availability of programs such as RosettaFold58 and AlphaFold259, capable of producing a decently-accurate structure for virtually all proteins and thus a good model for phasing of crystallographic data by molecular replacement. Latest releases of the two programs were published in the final stage of the writing of this manuscript, hence we asked whether or not the availability of these tools would have facilitated our journey towards the Cry11 toxins structures, and submitted the sequence of Cry11Aa to the two servers. For RosettaFold, the r.m.s.d. to the final refined structure of the five best models was over 4 Å, with discrepancies observed mostly in domain II. For AlphaFold2, however, the two first models displayed r.m.s.d. of 1.2 and 1.0 Å to the final structure, respectively. Using the worst of these two models, we could find a molecular replacement solution using Phaser, and a partial model featuring 95% of the residues in sequence was obtained after 20 cycles of automatic iterative model-building and refinement using Bucanneer60 and Refmac561. Thus, a problem which occupied five crystallographers for several years could have been solved in less than an hour using the new tools recently made available to the structural biology community. Based on our results, it is tantalizing to claim that the phase problem in crystallography has been solved, or that experimental structural biology will be abandoned, but such assertions would likely be shortsighted. Rather, we encourage investigators to challenge AlphaFold2 and RosettaFold as much as humanly possible, but to not forsake de novo phasing as it may remain the only route to success in difficult cases where molecular replacement based on such models does not work62. It must also be emphasized that in the case of Cry11 toxins and, more generally, naturally-crystalline proteins, the issue is not just phasing, but packing. For such proteins, crystal formation and dissolution serve function, hence characterization of packing interfaces is central to finely comprehend their bioactivation cascades. Without the naturally-occurring crystals and the atomic resolution experimental SFX data, it would not have been possible to make predictions on potential mutations affecting Cry11Aa crystal formation or dissolution./p>